Flowcytometrische detectie van plantpathogene bacteriën

Algemeen kader

Zijn flowcytometrische toepassingen bekend uit andere sectoren bv. voeding, medische wereld ook toepasbaar voor fytopathologische analyses? Wat zijn de mogelijkheden van flowcytometrische levend/dood analyse bij plantpathogenen? Zijn fytopathogenen opspoorbaar via flowcytometrie? Is een specifieke detectie mogelijk van lage concentraties plantpathogenen? Wat leren we uit de vergelijking qPCR - flowcytometrie op gebied van technische mogelijkheiden en economische relevantie? Voor dit onderzoek werd de detectie van Pseudomonas cichorii als casestudy gebruikt. P cichorii is een slapathogeen die in lage concentraties voorkomt in irrigatiewater. De pathogeen is moeilijk opspoorbaar maar leidt tot aanzienlijke oogstverliezen in de slateelt.

Onderzoeksaanpak

In eerste instantie optimaliseren we de methodologie voor de flowcytometrische detectie van bacteriën via levend/dood analyse. Vervolgens evalueren we beadsystemen voor de specifieke detectie van bacteriën. Hierbij wordt gebruik gemaakt van immunomagnetische scheiding (IMS). Antilichaambindingen zorgen voor specificiteit terwijl magnetische beads toelaten de bacteriën te concentreren via magnetische scheiding.  We maken een combinatie van IMS en levend/dood kleuring om de bacteriën te analyseren met de flowcytometer. De combinatie van deze technieken is experimenteel en nog zelden geprobeerd. Het ontwikkelde model testen we eerst op laboculturen. Vervolgens trachten we de techniek te valideren met praktijkstalen (irrigatiewater). Irrigatiewater is een heel moeilijke en variabele matrix.

Relevantie/Valorisatie

Uit het onderzoek blijkt dat flowcytometrie voor fytopathologisch onderzoek potentieel heeft. Onverwachte resultaten hebben we verkregen met de voorbeeld bacterie Pseudomonas cichorii. Deze bacterie laat zich zeer moeilijk opsporen in praktijkstalen. Dit komt doordat mechanische stress een negatieve invloed heeft op de overleving van de bacterie. Met flowcytometrische analyses in combinatie met qPCR hebben we dit kunnen aantonen. Tot voor dit onderzoeksproject was het optreden van deze stress onbekend in Pseudomonas cichorii en algemeen is weinig bekend over apoptose en autolyse in bacteriën. De flowcytometrische resultaten vinden naar grote waarschijnlijkheid verdere toepassingen omdat de ontwikkelde technologie ruim toepasbaar is. Levend/dood kleuringen zijn eenvoudig uitvoerbaar en blijken eenvoudig in zowel bodem- als waterstalen voor de evaluatie van microbieel leven. In de marge van het project hebben we verder goede resultaten verkregen voor diversiteit in plantpathogene schimmels via bepalingen van genoomgrootte. Ook kunnen we uit enkele testanalyses   opmerken dat de flowcytometrische analyse van plantvirussen via IMS eenvoudiger is dan de detectie van bacteriën.